Sn-Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase에 관한 연구 [V] Affinity Chromatography에 의한 사람 태반의 $alpha$-glycerophosphate 탈수소 효소의 정제 및 성상에 관한 연구

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사람 태반조직에서 세포질에 있는 NAD 의존성 $alpha$-Glycerophosphate 탈수소 효소(sn-glycerol-3-phosphate: $NAD_+$ 2-oxidoreductase EC 1.1.1.8)의 분포를 관찰하였으며 이 효소를 정제하였다. 또 mitochondria에 있는 FAD 의존성 $alpha$-Glycerophosphate 탄수소 효소(sn-glycerol-3-phosphate: cytochrome oxidoreductase, EC 1.1.99.5)의 분포를 관찰하였다. 세포질의 NAD 의존성 효소의 활성도는 White and Kaplan 법으로 mitochondria에 있는 FAD 의존성 효소의 활성도는 Dawson and Thorne의 방법으로 각각 측정하였다. 사람 태반조직 1g당 NAD 의존성 효소의 활성도는 homogenate에서 14 unit이며 세포질에서는 13.3 unit로 세포질분획에 95%가 함유되어 있다. FAD 의존성 효소의 활성도는 homogenate에 약 33 unit이 며 mitochondria 분획에는 약 29 unit로 mitochondria 분획에서 약 87%가 회수되었으며 세포질에는 전혀 효소의 활성이 없었다. NAD 의존성 및 FAD 의존성 $alpha$-glycerophosphate 탈수소효소의 비활성도는 각각 0.41 및 2.83으로 FAD 의존성 효소가 NAD 의존성 효소보다 비활성도가 약 7배 높았다. 세포질에 있는 NAD 의존성 이 효소를 ammonium sulfate에 의한 침전, blue dextran-Sepharose column chromatography 및 DEAE-cellulose column chromatography 등으로 655배 정제하였으며 polyacrylamide gel 전기영동으로 측정한 분자량은 61,500이다. 정제된 이 효소는 DEAE-cellulose column chromatogram상에 단일 peak의 효소활성을 나타낸 점으로 보아 single major isozyme으로 되어 있는 것 같다. 정제된 이 효소의 반응 최적 온도는 $55^{circ}C$이며 반응 최적 pH는 9.5이다. NAD 의존성 이 효소의 $alpha$-glycerophosphate 및 $NAD_+$에 대한 Km 값은 각각 3.6mM 및 0.38mM이다. 이 효소를 $55^{circ}C$에서 10분간 처리하였을 때 효소 활성이 약 50%가 감소하였다. 이 효소는 비교적 열에 대하여 안정한 것 같다. $K^+$은 낮은 농도인 $1.0{ imes}10^{-6}M$에서 NAD 의존성 효소의 활성을 약 75% 억제하였다. 그러나 $Na^+$은 $1.0{ imes}10^{-6}M$에서 효소의 활성이 약 25% 억제되었으며 농도의 증가에 따라 점차적으로 더 억제되었다. $Ca^{++}$의 경우 $1.0{ imes}10^{-6}M$ 농도에서 효소활성이 약 72% 억제되었으나 농도의 증가에 따라 억제현상이 감소됨을 알 수 있었다. $Mg^{++}$ 경우 $1.0{ imes}10^{-6}M$에서는 효율활성이 약 43% 촉진되었으며 농도의 증가에 따라 효율활성이 억제되었다. p-Chloromercuribenzoate는 $1.0{ imes}10^{-6}M$ 농도에서 정제된 NAD 의존성 효소의 활성을 약 25% 억제하였으며 농도의 증가에 따라 억제현상도 증가되어 $1.0{ imes}10^{-2}M$에서는 약 88%가 억제되었다.

기타언어초록

The distribution and some properties of $alpha$-glycerophosphate dehydrogenase of human placenta have been studied. Cytosolic NAD-linked $alpha$-glycerophosphat dehydrogenase (sn-glycerol-3-phosphate : $NAD^+$ 2-oxidoreductase, EC 1.1.1.8) activity was assayed by the method of White and Kaplan. The activity in homogenate was found to be 19. units per g wet tissue and was recovered in cytosolic fraction(specific activity: ca. 0.4). The activity of mitochondrial FAD-linked $alpha$-Glycerophosphate dehydrogenase (sn-glycerol-3-phosphate : cytochrome oxidoreductase, EC 1.1.99.5) was measured by the procedure of Gonzalez-Cerozo and Dalziel. The activity in homogenate was 33 units and was recovered about 87 per cent in mitochondrial fraction(specific activity: 2.8). Thus, the specific activity of FAD-linked enzyme in mitochondria was found to be about seven-fold greater than that of NAD-linked enzyme in cytosol. Cytosolic NAD-linked $alpha$-glycerophosphate dehydrogenase from human placenta has been purified about 655 fold by ammonium sulfate precipitation and affinity chromatography on blue dextran-Sepharose column and followed by DEAE-cellulose column chromatography. The elution profile of NAD-linked enzyme from cytosolic fraction was found to be a single major isozyme on the DEAE-cellulose column chromatogram. The molecular weight was estimated to be 61,500 by acrylamide gel elecarophoresis in the presence of dodecyl sulfate. The optimal pH was 9.5. Optimal temperature was 55, at this point, incubation for 10 min produced about 50 per cent inhibition of the enzyme activity. Data with prolonged heating suggested that the enzyme is relatively stable to thermal inactivation. p-Chloromercuribenzoate at a concentration of $10;{mu}M$ produced a 25 per cent inhibition of the enzyme and the increase in the concentration exhibited a gradual inhibition. $Na^+$ of $1.0{mu}M$ concentration also exhibited about 25 per cent inhibition. The same concentration of $K^+$ showed more strong inhibition and the enzyme retained only 25 per cent of original activity. $Ca^{++}$ inhibited the enzyme to a slightly lesser extent. In contrast, the same concentration of $Mg^{++}$ stimulated about 40 per cent of the enzyme activity. However, the greater concentration showed inhibitory effect.

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