시금치 잎으로 분리한 glycolate oxidase의 속도론적 성질을 정류상태 (steady-state condition)에서 연구하였다. 고등식물의 glycolate oxidase는 glycolate 산화반응 이외에도 L-lactate와 glyoxylate 산화반응에도 촉매역활을 수행한다. 본 연구에서는 제 2의 기질로 2,6-dichlorophenol-indophenol (DCPI)와 $O_2$를 이용하여, steady-state 조건에서 glycolate, L-lactate 산화반응에 대한 반응 속도흔적 연구를 수행하였다. 기질의 여러 농도에서 측정한 반응속도의 이중-역수 작도는 모든 조건에서 교차형(intercepting pattern)을 보여 주므로 glycolate oxidase 반응은 ternary complex를 거치는 sequential 메카니즘으로 판단된다. Steady-state에서의 반응 속도론적 상수, $K_s$, $Ko_2$, $K_{DCPI}$, and $K_d$ 등은 이중-역수 작도의 절편과 기울기의 2차 작도로 부터 구하였다. [2-$^2H$]-lactate을 이용하여 중수소 동위원소의 효과를 조사한 결과, $V_H/V_D$는 pH에 따라 변하며, pH 6-9 범위에서 $V_{H}/V_{D}$가 5-3이 얻어졌다. 그러므로 반응속도 결정단계는 pH에 따라 변하며, 산성조건에서 C-H 결합의 분열단계가 주된 반응속도 결정단계로 여겨진다.
The kinetic properties of glycolate oxidase from spinach have been studied under steady-state conditions. Glycolate oxidase from higher plants catalyzes the oxidation of glyoxylate and L-lactate in addition to glycolate oxidation. In this work we have carried out the kinetic studies of the oxidation of glycolate and L-lactate by glycolate oxidase with sodium 2,6-dichlorophenol-indophenol (DCPI) and oxygen as an electron-acceptor. Under steady-state conditions with different concentrations of substrate and electron-acceptor, intercepting patterns are observed in double-reciprocal plots. This is suggestive of a ternary complex (sequential) mechanism. Kinetic parameters, $K_s$, $Ko_2$, $K_{DCPI}$, and $K_d$ are obtained from secondary plots of intercepts and slopes of double-reciprocal plots. Deuterium isotope effect ($V_H/V_D$) with [2-$^2H$]-lactate were observed to be pH dependent, and the value of $V_H/V_D$ were varied from 5 to 3 in the pH range between 6.0 and 9.0. This is indicative that rate-limiting step is pH dependent and C-H bond-breaking is major rate-limiting step in acidic condition.
