제한효소 Eco RI을 histidine residue에 반응하는 diethylpyrocarbonate(DEP)와 반응시킨 결과 효소 활성이 감소함을 알 수 있었다. 효소 활성이 90% 정도 감소할 때까지 반응은 pseudo-first order kinetics를 따랐고 DEP와 더 반응시키면 효소 활성이 완전히 없어졌다. DEP에 의한 효소의 비활성화는 기질인 pUC9 DNA에 의해 보호됨을 알 수 있었고 1개의 histidine residue가 효소 활성에 관여하는 것으로 나타났다. 그리고 DEP에 의해 비활성화된 효소에 과량의 hydroxylamine을 첨가하여 주면 재활성이 나타났다. 한편 histidine residue의 역할을 알아보고자 DEP가 제한효소 EcoRI의 기질 결합 능력에 미치는 영향을 조사하였다. 효소의 기질 결합 능력도 DEP 농도를 증가시킴에 따라 감소하였고 기질에 대한 보호 효과와 hydroxylamine에 의한 재활성화가 위의 효소 비활성화와 비슷하게 나타났다. 따라서 제한효소 EcoRI의 비활성화는 기질에 결함을 하지 못함으로써 나타난 것으로 생각된다. 이런 결과에 따르면 제한 효소 EcoRI의 활성에 histidine residue가 관여하며 이 residue는 기질에 대한 결합 기작에 관여하는 것으로 사료된다.
Treatment of EcoRI endonuclease with the histidine modification reagent, diethylpyrocarbonate(DEP), resulted in enzyme inactivation. The reaction followed pseudo first-order kinetics until 90 to 95% of the enzyme had been inactivated. And prolonged incubation with DEP resulted in complete inactivation. When the modification reaction was carried out after preincubation with pUC9 DNA as substrate, the rate of inactivation was significantly decreased. The kinetics of inactivation indicate that the reaction of 1 molecule of DEP reagent is necessary for inactivation of each active site in EcoRI endonuclease. The inactivation of EcoRI endonuclease by DEP was partially reversed upon addition of excess hydroxy lamine. The effects of DEP on the binding ability of EcoRI endonuclease to its substrate, pUC9 DNA, were also investigated. When EcoRI endonuclease was preincubated with substrate DNA, the binding capacity was recovered significantly which suggests protection of the binding activity from DEP. Binding activity was also recovered with addition of hydroxylamine. The inhibition of activity, protection by DNA from DEP modification or reactivation by addition of hydroxylamine show similar tendencies to that of catalytic and binding properties. The cumulative results suggest that histidine residue plays a very important role as a binding residue in EcoRI endonuclease.
