키모트립신의 촉매 작용하에 진행되는 메틸 트란스-신나메이트의 에스테르 가수분해 반응의 속도를 $25^{circ}C$, pH 6.10 혹은 pH 7.85에서 첨가된 메탄올 존재 하에서 정류상태 조건하 혹은 비정류상태 조건하에서 측정하였다. pH 6.10에서 비정류상태 조건하에서 측정한 흡광도 변화로부터 중간체가 축적되었다가 파괴되는 것을 관찰할 수 있었지만, pH 7.85에서 측정한 흡광도는 단순한 유사 일차속도 행동만을 보였다. 속도자료를 비정류상태 속도방정식을 사용하여 분석한 결과 축적되는 중간체는 부차적인 평형반응의 생성물이 아니라, 진정한 중간체로서 반응생물을 형성하는 것임을 알 수 있었다. 따라서, 비정류상태 속도론적 방법은 축적되는 중간체가 생산적인 중간체인지 여부를 판별하기 위하여 효소 반응의 메카니즘 연구에 일반적으로 사용될 수 있는 것이다.
Kinetics of the chymotrypsin-catalyzed ester hydrolysis of methyl trans-cinnamate were measured under either steady-state conditions or non-steady-state conditions at $25^{circ}C$ and pH 6.10 or pH 7.85 in the presence of added methanol. The absorbance changes observed under the non-steady-state conditions at pH 6.10 demonstrated the accumulation and breakdown of an intermediate, but those at pH 7.85 manifested simple pseudo-first-order behavior. Analysis of the kinetic data in terms of the non-steady-state kinetic equations indicated that the accumulating intermediate is the true intermediate leading to the product, instead of being a side equilibrium product. The non-steady-state kinetic method, therefore, may be generally utilized in the mechanistic study of enzymatic reactions to determine whether accumulating intermediates are productive ones or not.
