생체내에서 생화학적 방법으로 분리가 용이하지 않거나 분리 후 성질이 달라지는 성분(또는 구성물)의 스펙트럼의 연구시, 각 성분의 스펙트럼이 서로 크게 중첩되면 그 분석이 용이하지 않다. 형광의 세기는 excitation 파장, emission 파장과 fluorescence yield를 변화시키는 어떤 chemical treatment의 함수로서 각 성분에 대한 값의 합으로 주어지므로 삼중선형 분석이 가능하다. 즉 이들 세 가지 독립변수들에 따라 데이타를 수집, 분석하면 그 성분의 성질에 대한 아무런 정보도 제공하지 않고 각 성분의 excitation 스펙트럼, emission 스펙트럼과 chemical treatment에 대한 변화를 알 수 있다. 이를 검정하기 위하여 그 스펙트럼이 매우 중첩된 fluorescing dye들, rhodamine 6G, rhodamine B, sulforhodamine 101의 혼합물을 사용하고, 세번째 독립변수로서 chemical quencher(potassium iodide)의 농도를 사용하여 분석한 결과는 pure dye들에서 얻은 결과와 거의 같았다. 종전의 삼중선형분석법의 적용시 예로 chromatography 법에서 세번째 독립변수로 elution time을 쓸 때와 같이 fluophore의 농도가 달라야 한다. 이 방법으로는 보다 실용적인 chemical treatment들을 독립변수로 사용할 수 있고, 그 algorithm에서 결과로 얻어지는 스펙트럼에 대한 non-negativity를 요구할 수 있다는 장점이 있다. 실제 이를 적용하였을 때, 보다 정확한 결과를 얻을 수 있었다.
The information contained in vivo fluorescence spectra of biological specimens is often obscured by severe overlapping of component spectra. Fluorescence intensity is separately linear in functions of excitation wavelength, emission wavelength, and any chemical treatment which alters overall fluorescence yield. When data are collected for several values of each of these three independent variables, strongly overlapping spectra can be resolved without the use of any a priori information about their shapes. Using concentration of a fluorescence quencher, potassium iodide, as a third variable, a mixture of rhodamine 6G, rhodamine B, and sulforhodamine 101 was used as a test system; the spectra resolved agreed closely with the spectra of the pure dyes. Previously published applications of trilinear analysis to luminescence spectroscopy have required either an instrument capable of time resolution or multiple specimens with varying relative concentrations of fluorophores; use of quencher concentration as a variable permits use of the method with a steady-state fluorometer and without changing fluorophore concentrations. Requiring that the spectra deduced be non-negative can increase the accuracy of the results.
