본 연구의 장기적 목표로, 미토콘드리아 막에 aldehyde dehydrogenase(ALDH)가 존재하는가? 그리고 존재한다면 어떤 구조와 기능을 갖는가? 를 알기 위하여 우선 쥐 간 미토콘드리아를 sucrose의 step gradient(1~2 M) 원심분리를 이용하여 순수분리하였고, 초음파로 파쇄한 후 초원심분리를 이용하여 순수한 미토콘드리아 막 분획을 얻었다. 미토콘드리아 막 분획에 ALDH가 존재하는가를 ALDH 활성 측정으로 확인하였다. 미토콘드리아 막 ALDH를 용해시키기 위하여 여러 가지 종류(Triton X-100, digitonin, Lubrol PX, cholate 그리고 Chaps)의 detergent를 여러 가지 농도(0.5%, 0.75%, 1%, 1.5% 그리고 2%)로 사용하여 조사한 결과 1% cholate가 가장 좋은 용해 조건이었으며, 또한 용해를 위한 최적의 염(NaCl) 농도와 pH 조건은 각각 1M과 9.0이었다. 또한 용해시 5 mg/ml phospholipid 첨가가 막 ALDH 활성을 증가시키는 안정제 역할을 하였다. 5 mg/ml phospholipid와 1% cholate를 함유한 sucrose의 linear gradient(3~10%) 원심분리를 이용하여 부분정제를 한 결과 처음보다 약 100배 정제된 것을 알수 있었고, 이 부분정제된 cholate-solubilized ALDH로부터 투석을 이용하여 cholate를 제거하여 proteoliposome을 만들어 활성을 측정한 결과 그 전보다 2배 이상 증가하였다.
To know the existance and structure and function of mitochondrial membrane aldehyde dehydrogenase (ALDH) as a final goal, mitochondrial membrane from rat liver was purified using sucrose step gradient (1~2 M) centrifugation, and then sonicated and ultracentrifuged to obtain pure mitochondrial membrane fraction. The observation of the ALDH activity from this fraction let us know the existance of mitochondrial membrane ALDH. The result that various kinds of detergent (Triton X-100, Digitonin, Lubrol PX, Cholate and Chaps) were examined as a good solubilizer at several different concentrations showed 1% cholate for the best one. In addition to this, the optimum salt (NaCl) concentration and pH for solubilization were 1 M and 9.0, separately. And also, the addition of phospholipid functioned as a stabilizer. The partial purification of ALDH from this cholate-solubilized membrane fraction with selected best conditions was tried using sucrose linear gradient (3~10%, including 1% cholate and 5 mg/ml phospholipid) centrifugation and was obtained more 100 times than crude mitochondrial state as a result. This partial purified, cholate-solubilized ALDH was dialyzed to remove the cholate and to make ALDH-incorporated vesicles. ALDH activity from this result was increased about 2 times than before dialysis.
