청각(1.2 kg)을 0.8% 염산 수용액(24 l)으로 추출한 추출물을 메탄올 환류, 에탄올 침전 및 투석하여 활성이 약 2배 증가된 조다당(CF-1)으로부터 2종의 항응고활성 다당류를 정제하였다. 정제는 CF-1의 DEAE-Toyopearl이온교환 크로마토그래피와 Sephadex G-75, Sephadex G-100, Sepharose CL-6B 겔여과 크로마토그래피, HPLC 등을 이용하였다. 최종 정제 다당류획분인 CF-1-VIa-1과 CF-1-VIIa-1는 분자량이 각각 80,000과 40,000 Da 이었으며, 주구성당으로서 arabinose와 galactose가 약 2:1의 몰비율로 풍부하게 함유되어 있었고, 구성당 잔기에 $12{sim}13%$의 유황을 함유하는 함황성 다당류들이었다. CF-1-VIa-1와 CF-1-VIIa-1의 항응고활성을 $2.5;{mu}g/mL$의 농도에서 비교하였을 때 APTT활성은 대조군에 비하여 각각 262초, 250초이었고 TT활성은 각각 130초, 70초이었으며, 분자량이 큰 CF-1-VIa-1이 다소 높은 항응고활성을 보였다. CF-1-VIa-1와 CF-1-VIIa-1의 desulfation과 sulfation을 통한 항응고활성을 비교한 결과 desulfation시 항응고활성이 각각 약 80%와 50%로 감소하였으나 sulfation시에는 약 30%와 20%로 그 활성이 증가하였다. 두 다당류는 헤파린과 달리 농도 의존적으로 불용성 피브린의 형성을 억제하므로써 antithrombin III 비의존적 트롬빈 저해활성을 나타내었으며, 칼슘이온의 킬레이트에 의한 혈액응고 저해효과는 나타내지 않았다.
We have isolated two anticoagulant polysaccharides from an acidic extract of Codium fragile. The purification was conducted using three consecutive chromatographies of DEAE-Toyopearl 650C, Sephadex G-100 (G-75), and Sepharose CL-6B by measuring activated partial thromboplastin time (APTT). The two purified anticoagulant polysaccharides, CF-1-VIa-1 and CF-1-VIIa-1, were found to be nearly homogenous on HPLC using a gel permeation column and appeared to have molecular weights of about 80,000 Da and 40,000 Da, respectively. The polysaccharides consisted mainly of arabinose and galactose in a molar ratio of about 2 : 1, and also comprised 12-13% of sulfates at their constituent sugars. CF-1-VIa-1 and CF-1-VIIa-1 inhibited blood coagulation via both the intrinsic and the extrinsic pathways. The polysaccharides unlike heparin showed an inhibitory activity on thrombin when a pure fibrinogen without antithrombin III was used as a substrate. Structural modifications using sulfation and desulfation affected the anticoagulant activities directly, suggesting that the content of sulfate plays an important role in the blood coagulation cascade. The polysaccharides may inhibit some proteases involved in the blood coagulation cascade, judging from the independence of calcium concentrations in their anticoagulant activity.
