가시오가피 냉침 추출물에서 면역자극활성을 가지는 지표물질을 분리하고자, gel chromatography를 수행하여 비장세포에 대한 증식활성을 가지는 EN-SP을 분리하였고, 생화학적 분석 결과 단백 다당 물질임을 확인하였다. 가시오가피 추출물 내에서 지표물질로서 EN-SP 성분을 정량하기 위하여 경쟁적 ELISA법을 개발하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 경쟁적 ELISA법을 이용하여 EN-SP-HRP conjugate의 희석농도를 1000배로 결정하였으며, EN-SP의 표준곡선을 작성한 결과 검출범위는 $0.2{sim}20;{mu}g/mL$으로서 측정감도는 $0.2;{mu}g/mL$이었다. 이러한 표준곡선의 정당성 평가를 위하여 정량된 EN-SP를 통한 재현성 실험에서 $5;{mu}g/mL$ 이하의 농도에서 intra assay 경우 C.V. 값은 $6.13{sim}8.81%$, bias는 평균 -3.7%를 보였으며, inter assay에서도 C.V. 값과 bias 모두에서 10%이내로 비교적 우수한 재현성을 보였다. 작성된 표준곡선을 바탕으로 유사물질인 오가피의 $4^{circ}C$ 추출물들의 EN-SP의 함유량을 조사한 결과 EN-SP 성분은 주로 가시오가피 외피에서만 높은 함유량을 보였다. 동일한 추출물의 macrophage 자극에 의한 cytokine 유도활성 실험결과, EN-SP 성분을 함유하는 가시오가피의 수피 추출물만 IL-12 및 $TNF-{alpha}$를 생산하는 면역자극활성을 나타냄으로서 EN-SP 성분은 가시오가피에서 면역자극활성을 나타내는 지표물질로의 가능성이 제시되었다.
This study was carried out to establish a quantitative analysis method of separating immuno-activating substance (EN-SP) from Acanthopanax senticosus (A. senticosus) by competitive direct ELISA. Mouse antiserum (anti-EN-SP) against EN-SP was generated by immunization (s.c.) of EN-SP purified from A. senticosus as an immunogen. The titer of anti-EN-SP was about 1 : 400, and the optimal dilution of EN-SP-HRP conjugate was 1 : 1,000. When the standard curve was constructed by ELISA, its sensitivity was about $0.2{mu}g/mL$. The coefficient variation of intra- and inter-assay were $6.13{sim}8.81%$ and $6.73{sim}8.60%$, respectively. According to the standard curve, the concentration of EN-SP in various senticosus extracts was found to be only $59.85;{mu}g$ in 10mg of extract from the bark of A. senticosus. Similarly, the immunostimulating activity to produce $TNF-{alpha}$ or IL-12 among the various extracts of Acanthopanax was shown to be correlated with the content of EN-SP. These results demonstrated that competitive ELISA was a convenient, fast, reproducible, and accurate method for the determination of EN-SP as an immunologically active standard substance in extract of A. senticosus.
