대장균 HB101에 MNNG를 처리하고 methyl viologen 여과지법을 이용하여 hydrogenase defective 변종을 분리하였다. 대장균의 DNA를 제한효소 EcoRI으로 부분가수분해 하고 플라스미드 pBR322의 EcoRI site에 접합 시켰다. 생성된 재조합 플라스미드로 hydrogenase defective 변종 대장균 HY1을 형질전환시켰다. 그 결과 hydrogenase를 생산하는 유전자를 갖는 플라스미드 pHY1 을 얻었다. 이 플라스미드는 대장균 HY2, HY3 및 LCB850을 형질전환시키지 못하였다. 대장균의 hydrogenase 야생종, 변이종 및 pHY1-10으로 형질전환된 변이종의 crude extract를 만들어 폴리아크릴아미드 전기영동법을 이용하여 hydrogenase activity를 분석하였다.
Hydrogenase defective mutants of Escherichia coli HB101 were isolated by MNNG-mutagenesis and methyl viologen filter paper screening method. E. coli DNA was digested with restriction endonuclease EcoRI and ligated into the EcoRI site of plasmid pBR322. The resulting recombinant plasmids were used to transform E. coli HY1, a mutant with a defective hydrogenase activity. Complementation of this hydrogenase mutation identified a bacterial clone carrying the gene for a E. coli hydrogenase in plasmid pHY1-10 This plasmid was not able to complement the other mutants, E. coli HY2, HY3, and LCB850. Polyacrylamide gel electrophoresis was used to analyze the hydrogenase(s) of the wild type, mutants, and mutant strains transformed with pHY1-10.
