- 인체 ${alpha}1$-antitrypsin cDNA의 분리 및 E.coli 내에서의 발현
- ㆍ 저자명
- 이상철,유명희,Lee. Sang-Chul,Yu. Myeong-Hee
- ㆍ 간행물명
- 한국생화학회지
- ㆍ 권/호정보
- 1989년|22권 2호|pp.148-153 (6 pages)
- ㆍ 발행정보
- 생화학분자생물학회
- ㆍ 파일정보
- 정기간행물| PDF텍스트
- ㆍ 주제분야
- 기타
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인체 간 cDNA library로부터 올리고 뉴클레오티드 프로브를 이용하여 ${alpha}1$-antitrypsin (${alpha}1$-AT) cDNA를 지닌 파지 클론을 스크린하였다. 선별된 클론에는 1.3 k bp의 DNA가 삽입되어 있었으며 이를 pUC9 벡터에 다시 클론닝하여 분석한 결과 이미 보고된 ${alpha}1$-AT cDNA 서열과 일치함을 알 수 있었다. ${alpha}1$-AT cDNA를 E. coli에서 발현시키기 위해 택 (tac) 프로모터에 의해 전사가 활성화되도록 발현벡터 pT-AT를 제조하였다. 플라스미드 pT-AT에 의해 형질전환된 E. coli JM109 균주에서 재조합 단백질의 발현을 유도한 결과 ${alpha}1$-AT의 활성이 검증되었으며, 발현된 ${alpha}1$-AT는 사람 피에서 정제한 ${alpha}1$-AT와 그 면역학적 특성이 동일함을 알 수 있었다. 또한 같은 세포 추출액을 SDS-polyacrylamide 젤 전기영동법으로 분석한 결과 Coomassie Brilliant Blue로 단백질 밴드를 염색했을 때는 발현된 ${alpha}1$-AT를 검증할 수 없었으나, ${alpha}1$-AT에 대한 rabbit IgG 항체와 펄옥시다제가 연결된 anti-rabbit IgG goat 항체를 사용하여 웨스턴 블릿을 한 결과 ${alpha}1$-AT 밴드가 기대했던 분자량 위치에서 확인되었다. 이와 같이 생산된 재조합 ${alpha}1$-AT는 본래의 ${alpha}1$-AT보다 분자량이 작은 것으로 나타났는데 이는 E. coli 세포내에서 발현된 ${alpha}1$-AT는 glycosylation이 안된 형태의 것이기 때문일 것이다.
Human ${alpha}1$-AT cDNA was screened from human liver cDNA library, by use of oligonucleotide probes. DNA insert of 1.3 kbp from a positive clone was subcloned into pUC9 plasmid and was analyzed by restriction enzyme digestion and partial DNA sequencing. The obtained gene was identical to human ${alpha}1$-AT cDNA reported previously. In order to express ${alpha}1$-AT cDNA under regulation of tac promoter, expression vector pT-AT was constructed. E. coli JM109 cells transformed with pT-AT showed ${alpha}1$-AT activity upon induction of recombinant protein synthesis. The recombinant ${alpha}1$-AT was immunologically identical to authentic ${alpha}1$-AT that was purified from human blood. When the recombinant cell lysates were analyzed on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, the expressed ${alpha}1$-AT was not detected by staining with Coomassie Brilliant Blue. However Western blotting of the same gel, using rabbit IgG against ${alpha}1$-AT and peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody, showed the existence of ${alpha}1$-AT at the expected molecular weight region. Molecular weight of recombinant ${alpha}1$-AT was slightly lower than that of authentic ${alpha}1$-AT; which presumably was due to lack of glycosylation inside E. coli cells.