토끼 헤모글로빈의 peroxidase 활성은 histidine에 비교적 특이하게 반응하는 diethylpyrocarbonate에 의하여 불활성화 되었다. 50 mM sodium phosphate 완충용액 (pH 6.0)을 사용하였을 때 $30^{circ}C$에서 modification되는 속도상수는 $220M^{-1}min^{-1}$이었으며, N-carbethoxylhistidyl 유도체의 생성으로 인한 242 nm에서의 흡광도 증가가 동시에 관찰되었다. 그러나 280nm에서의 흡광도 변화는 관찰되지 않았으며 토끼 헤모글로빈의 peroxidase 활성은 N-acetylimidazole, phenylglyoxal 및 N-ethylmaleimide 등에 의하여 활성이 저하되지 않았다. Hydroxylamine은 peroxidase 활성의 inhibitor로 작용하기 때문에 diethylpyrocarbonate에 의하여 불활성화된 토끼 헤모글로빈의 peroxidase 활성을 회복시키지 못했지만, 기질인 guaiacol은 diethylpyrocabonate에 의한 불활성화를 약간 감소시켰다. Tsou의 통계적 분석방법에 의하여 peroxidase 활성이 완전히 사라질 때 헤모글로빈 1분자당 11개의 histidine 잔기가 modification되었으며 그 중 1개의 histidine만이 peroxidase 활성에 필수적인 것으로 밝혀졌다. 또한 5 mM $H_2O_2$로 처리한 토끼 헤모글로빈의 경우 diethylpyrocarbonate에 의한 불활성화가 촉진되고, diethylpyrocarbonate로 modification된 apohemoglobin이 native 헤모글로빈으로 재조합하지 못하는 것으로 보아 essential histidine이 heme 근처의 distal histidine일 것으로 추정된다.
Diethylpyrocarbonate inhibits the peroxidase activity of rabbit hemoglobin with a second order rate constant of $220M^{-1}min^{-1}$ at pH 6.0 and $30^{circ}C$. The increase in absorbance at 242 nm due to formation of carbethoxyhistidyl derivatives and other modification studies suggest that the modification of histidine residues is responsible for the loss of activity. However, treatment of inactivated hemoglobin with hydroxylamine does not restore catalytic activity due to the inhibitory effect of hydroxylamine itself on the peroxidase activity of hemoglobin. The substrate guaiacol have partially reduced the diethylpyrocarbonate dependent inactivation, and a reconstitution experiment using diethylpyrocarbonate treated apohemoglobin shows that it is not reconstituted to hemoglobin having full activity. The decrease of absorption at Soret region (406 nm) upon diethylpyrocarbonate modification of native hemoglobin and the acceleration of inactivation by preincubation of the diethylpyrocarbonate inactivated hemoglobin with $H_2O_2$ (5 mM) implies that the essential residue is distal histidine as previously proposed in case of cytochrome C peroxidase.
